كيمياء

المقرر العملى 5: معكوس PCR - حذف القطع الجينية


قالب الحمض النووي

قالب الحمض النووي هو القالب الذي سيتم تكراره (تضخيمه) بواسطة PCR.

القالب (إنجل. النموذج "template"، "pattern") هو في معظم الحالات DNA أحادي الجديلة أو مزدوج الجديلة. يمكن أيضًا استخدام جزيئات الحمض النووي الريبي كقوالب لـ PCR ، ولكن يجب أولاً تحويلها إلى DNA عن طريق النسخ العكسي. لا تتعرف بلمرة الحمض النووي إلا على الحمض النووي كركيزة.

في فحوصات الطب الشرعي ، غالبًا ما تُستخدم الخلايا الكاملة مباشرةً من أجل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، على سبيل المثال من آثار الدم والحيوانات المنوية أو من جذور الشعر. هنا ، يجب أن يتطابق التمهيدي المحدد مع الحمض النووي المطلوب على النحو الأمثل من أجل الحصول على أقل عدد ممكن من المنتجات الثانوية غير المحددة في PCR ، والتي تحتوي في ظل هذه الظروف على عدد كبير من جزيئات الحمض النووي الخلوية المختلفة.

من حيث المبدأ ، يكون جزيء واحد من قالب DNA كافيًا لـ PCR (انظر أيضًا التطبيقات في علم الحفريات). ومع ذلك ، فإن محصول PCR يعتمد بشكل كبير على جودة جزيء DNA هذا. في عينات الحمض النووي من العظام الأحفورية أو من الجثث المتحللة بشدة ، غالبًا ما يتلف الحمض النووي بسبب عملية الشيخوخة أو ظروف التخزين. في هذه الحالة ، يجب أن يكون القالب نقيًا إلى حد ما في مجموعة الاختبار. مع كل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من الضروري التأكد من عدم وجود تلوث ، على سبيل المثال من نُهج تفاعل البوليميراز المتسلسل السابقة (تحمل أكثرالتأثير) من خلال خلايا الجلد لموظفي المختبر أو المواد المستخدمة. في قضية قتل بارزة ، أدى ذلك إلى نتائج مفاجئة للغاية (تقرير عن Stern.de ، 26 آذار (مارس) 2009).

معلمات النموذج الأمثل

يؤثر عدد من المعلمات على جودة الحمض النووي لـ PCR:

  • التلوث الكيميائي من عملية عزل الحمض النووي البلمرة إنزيم حساس. حتى آثار المواد الكيميائية مثل الفينول والعوامل المخلبية مثل EDTA1)الكلوروفورم والمنظفات (SDS2)، ساركوسيل) أو الإيثانول يمكن أن يثبط تفاعل البوليميراز المتسلسل. تُستخدم هذه المواد الكيميائية في عزل الحمض النووي ويجب إزالتها تمامًا من الحمض النووي قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  • كميات الحمض النووي المستخدمة في حالة استخدام أقل من 10 نانوغرام من الحمض النووي الجيني في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب زيادة عدد الدورات مرة واحدة بداية ساخنةيمكن إجراء -PCR لزيادة إنتاجية وخصوصية التفاعل ، والكميات المثلى هي 1-10 نانوغرام للحمض النووي البكتيري ، و 0.1-1 نانوغرام للحمض النووي البلازميدي والحد الأقصى 200 نانوغرام من الحمض النووي الجيني.


فيديو: مراجعة ليلة الامتحان - دراسات - الصف الخامس الابتدائي -ترم اول 2020 (ديسمبر 2021).